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标准物质角鲨烯的制备方法有哪些?


一、背景及概述


角鲨烯是由6个异戊二烯连接而成的高度不饱和的直链三萜类化合物,别名鲨萜、三十碳六烯、鱼肝油萜或角鲨油素,系统命名为2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯,分子式为C30H50,常温下为淡黄色或无色油状液体。角鲨烯具有提高缺氧耐受力功能、抑制微生物生长、抗菌消炎、调节胆固醇代谢等生物活性功效。而且角鲨烯是一种具有抗衰老、抗癌作用的无毒性的强化剂。角鲨烯来源广泛,存在于微生物、植物种籽、微藻、鲨鱼肝脏及人体皮脂中。


二、制备方法


方法一、


一种从裂殖壶菌中提取角鲨烯的方法,包括以下步骤:


S1、裂殖壶菌的培养:


S11、将裂殖壶菌转接于斜面,于25℃下培养3~4d,将裂殖壶菌活化,然后用接种环挑取活化的裂殖壶菌,接入一级种子培养基中以25℃、200r/min培养2d,得到一级种子,最后再取一级种子接入二级种子培养基中,以25℃、200r/min培养2d,得到二级种子;其中,一级种子培养基和二级种子培养基均由30g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物和15g/L矿物质组成;矿物质由10g/LNaCl、0.5g/LCaCl2·2H2O、1.5g/LMgSO4·7H2O、1.25g/LK2SO4、0.75g/LKH2PO4、0.7g/L(NH4)2SO4和0.3g/LFeSO4·7H2O组成;


S12、将二级种子按照6%的接种量转入发酵机构中的发酵培养基进行发酵培养,罐压0.025MPa,通气量5L/min,搅拌速度40r/min,发酵6d,得到发酵液;其中,发酵培养基由120g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、30g/L矿物质和0.15g/L复合维生素组成,矿物质由18g/LNaCl、1.5g/LCaCl2·2H2O、3.5g/LMgSO4·7H2O、2.25g/LK2SO4、1.75g/LKH2PO4、2g/L(NH4)2SO4和1g/LFeSO4·7H2O组成,复合纤维素由60mg/L维生素B6、30mg/L维生素B12、20mg/L核黄素、10mg/L烟酸和30mg/L叶酸组成;在发酵培养过程中分批流加葡萄糖,每隔8~12h加一次,每次加30g/L;


S2、裂殖壶菌的破壁:


将步骤S12得到的发酵液转入酶解机构中,往其加入碱性蛋白酶,对裂殖壶菌进行酶解破壁,酶解温度为63℃,pH为7.8,酶解时间为6h;


S3、角鲨烯的提取:


S31、在步骤S2破壁后得到的菌液中加入无水乙醇,菌液和无水乙醇的体积比为1:1.2,经过离心机构振荡离心分离除去上清液水-乙醇相,收集底层菌泥;


S32、在底层菌泥中加入正己烷,底层菌泥和正己烷的体积比为1:1.15,经离心机构振荡离心收集上清液,重复若干次,直到上清液无色透明,最后蒸发去除正己烷,收集得到角鲨烯粗品;


S4、角鲨烯的纯化:


将步骤S3得到的角鲨烯粗品进行脱胶、脱酸、漂白和脱臭处理,得到纯化的角鲨烯。


方法二、


a、取新鲜油茶籽300公斤,用清水洗净、凉干、切碎后置入提取罐中;


b、向罐中加入1.5-2.4吨85%的乙醇(重量含量),加热(温度为60-70℃)回流提取2-3小时,滤出浸提液,另加入1.5-2.4吨85%的乙醇(重量含量),又煮沸浸提2-3小时,滤出浸提液后弃渣;合并两次浸提液,备用;


c、将上述备用的浸提液加热(温度为60-70℃)浓缩,回收乙醇,收集浓缩液200升备用;


d、向上述备用的浓缩液中加入0.4-1.0mol/L的氢氧化钠-甲醇溶液(氢氧化钠的用量为0.3-0.8公斤,甲醇的用量为20升)共20升,然后,将其置于70℃的水浴中,在氮气保护下回流反应4小时,冷却6小时,溶液与沉淀分离,甲酯化反应完成,滤出混合液备用;


e、将上述备用的混合液经0.01mol/L配位剂-硼砂反应,采用大孔树脂色谱分离纯化,并采用50-70%乙醇(重量含量)洗脱,乙醇的用量为2个柱体积,然后收集乙醇洗脱液备用;


f、将上述备用的乙醇洗脱液在60-70℃条件下加热浓缩,回收乙醇,得无乙醇浓缩液200升备用;


g、向上述备用的无乙醇浓缩液中加入200-400升的石油醚,常温萃取0.5-1小时,滤出萃取液;再加入200-400升的石油醚,常温萃取0.5-1小时,滤出萃取液,然后,合并两次萃取液备用;


h、将上述备用的萃取液用400-800升的清水分为2-3次进行洗涤,洗涤后,收集上清液(即:石油醚溶液)备用;


i、将上述备用的上清液(即:石油醚溶液)在30-40℃条件下加热浓缩,回收石油醚,得角鲨烯粗油8公斤备用;


j、将上述备用的角鲨烯粗油进行超临界CO2萃取,得角鲨烯精油(大约为1公斤左右),备用;


k、将上述制得的角鲨烯精油用气相色谱法测试,若角鲨烯含量≥80%,即为成品,若角鲨烯含量≤80%,则重复上述第j步骤。


L、当上述制得的角鲨烯精油中的角鲨烯含量≥80%后,即可用于制作茶油角鲨烯软胶囊:


①取明胶、甘油、水按1.0∶0.4∶0.6的比例(重量配比)制备成胶囊壳,备用;


②按重量百分比份额分别取:


角鲨烯含量≥80%的角鲨烯精油87份、聚乙二醇4005份、蜂蜡3份、磷脂5份,合计为100份,混合均匀,灌装于胶囊壳中,即制得茶油角鲨烯软胶囊成品。


方法三、


一种络合提取角鲨烯的工艺,该方法包括如下步骤:


(1)备料:将1kg新鲜油茶树的种仁,用清水洗去表面附着的污物,去皮壳破碎;所得物与石油醚按1:5质量比混合超声(160W,30min,3次),合并提取液,过滤,经减压浓缩获得山茶油脂溶性物质浓缩液(其中角鲨烯含量10g/L);


(2)提取:将步骤(1)得到的山茶油脂溶性物质浓缩液与氢氧化钠的甲醇溶液混合,50℃水浴加热、搅拌回流2h,其中,氢氧化钠浓度0.7mol/L,山茶油脂溶性物质浓缩液与氢氧化钠的甲醇溶液的体积比为1:20,通过皂化和甲酯化反应除去脂肪酸,再用石油醚提取角鲨烯,即角鲨烯粗品;


(3)络合:将步骤(2)得到的角鲨烯粗品(其中,角鲨烯含量8200μg/mL)和0.6mol/L硝酸银-65v/v%甲醇水溶液等体积混合,使得角鲨烯粗品中的角鲨烯与硝酸银的摩尔比为1:30;在0℃下,振荡或搅拌进行络合反应12h;


(4)解离:低温下,静置、分液,获得中间产物银离子-角鲨烯络合物的水溶液,即络合后的水相,加入等体积石油醚;在50℃恒温水浴锅中加热回流,解离反应80min;得到较纯的含角鲨烯有机溶液;


(5)纯化:将步骤(4)得到的较纯的含角鲨烯石油醚溶液,用6.15mol/LNaCl水溶液清洗,在50℃,0.05Mpa条件下减压蒸馏,回收石油醚;再次蒸馏水清洗后,在20℃、500mmHg条件下真空干燥7h,即得到5.2g角鲨烯精品,其含量接近93%,总收率88.3%。


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