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D-叔亮氨酸的背景与概述及制备方法!


一、背景及概述


D-叔亮氨酸是非常重要的非天然氨基酸,是多种药物的中间体。因其侧链是一个叔丁基,有很大的空间位阻,在和其它分子耦联后有利于维持空间构象,同时形成的酰胺键不容易被体内的酶识别降解。氨基酸是指既含有氨基的羧酸的有机化合物,不同氨基酸的之间区别在于它们侧链R基团的不同,自然界中到目前为止共发现有300多种氨基酸,根据是否是构成天然蛋白质的基本组成成分,氨基酸可分为天然氨基酸和非天然氨基酸,非天然氨基酸是指人工合 成的各种氨基酸。除甘氨酸外,氨基酸都有不对称碳原子,呈旋光性,根据空间排列位置不同,可以分为D-氨基酸和L-氨基酸两种,不同旋光氨基酸在生物体内发挥着不同的生理作用。


二、制备方法


一种改造的来源于Symbiobacterium thermophihum的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶(StDAPDH)变体生物催化剂,该催化剂可以被用来还原氨化合成ee值>99%的D-叔亮氨酸


突变酶蛋白的获取步骤如下:


1、以pET32-Dapdh质粒为模板,通过QuickChangeMutagenesisKit突变试剂盒引入W121L、F146L、H227F三位点组合突变,并对突变质粒进行测序验证;


2、将突变质粒以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌构建成工程菌;


3、对构建的工程菌进行培养、诱导表达,突变体蛋白以可溶性形式存在于胞内;


4、将突变体蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化至SDS-PAGE单条带;


5、将纯化后的突变子蛋白脱盐浓缩,用于建立催化反应体系。


D-叔亮氨酸合成方法为:


在葡萄糖/葡萄糖脱氢酶辅酶NADPH循环再生体系的存在下,反应体系中的底物3,3-二甲基-2-羰基丁酸和氯化铵,在加入生物催化剂StDAPDH突变体后,于30℃反应24小时,每毫升反应体系中生物催化剂的用量约为0.5U。


反应产物构型检测方法为:


向反应产物中加入高氯酸/加热变性蛋白质后,离心取上清,对上清中的产物进行FDAA衍生,利用L、D-叔亮氨酸标样做对照,经高效液相色谱进行分析,根据产物的保留时间,确定产物构型以及ee值。


本方法中,通过StDAPDH突变子的还原胺化作用,3,3-二甲基-2-羰基丁酸和氯化铵的催化反应可以获得大于99%的对映选择性(ee)的D-叔亮氨酸。


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