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蛋白质转印印迹膜萘酚蓝黑(NBB)染色试剂盒的应用!


一、背景


蛋白质转印印迹膜萘酚蓝黑(NBB)染色试剂盒主要用于对聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶和硝酸纤维素膜上蛋白质的染色。


萘酚蓝黑为黑褐色粉末,可溶于水,水溶液呈蓝黑色,加入浓盐酸产生绿光蓝色沉淀;加入氢氧化钠溶液产生蓝色沉淀。溶于乙醇,呈蓝色,微溶于丙酮,不溶于其他有机溶剂。于浓硫酸中呈蓝光绿色,稀释后产生暗绿光蓝色沉淀;


于浓硝酸中呈暗绿色溶液后转变为酱红色;于10%氢氧化钠溶液中产生蓝色沉淀。染色时,遇铜离子色泽略有变化;遇铁离子色泽略带浅绿。


萘酚蓝黑主要用于对聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶和硝酸纤维素膜上蛋白质的染色。在电泳后,推荐固定蛋白质在胶上。


胶用0.1%氨基黑10B的7%(v/v)醋酸溶液染至少2小时,然后用7%(v/v)醋酸溶液脱色。检测灵敏度大概是考马斯亮蓝R250的20%。


二、实验开始前完成蛋白质电泳和转印然后进行下列操作:


6 cm X 8 cm大小的含有蛋白的印迹膜置于染色塑料盒里小心加入5毫升染色液,覆盖膜表面;


室温下,孵育5分钟,或直至条带显现,避免光照;倒掉染色液;


加入适量的无离子水清洗,直至背景清晰(注意:不要过度清洗,造成褪色);


取出印迹膜烘干;


去色处理将染色后的印迹膜置于染色塑料盒里加入适量的无离子水清洗,倒掉无离子水,小心加入25毫升去色液,覆盖膜表面;室温下,孵育15秒,或直至条带消失;倒掉去色液,加入适量的无离子水清洗3分钟;


继续各种后续,例如测序、免疫杂交等。


三、应用


用于家蚕蚕蛹过敏原蛋白质组学和分子生物学研究:


对家蚕蚕蛹的过敏原进行研究。


1、家蚕蚕蛹过敏原的SDS-PAGE和免疫印迹分析:首先利用超速离心法提取家蚕蚕蛹的总蛋白,用12%的SDS-PAGE对蛋白粗提液进行分离,之后分别用11份家蚕蚕蛹过敏病人的血清与蛋白进行IgE结合测试。


结果发现:家蚕蚕蛹的蛋白有10多条蛋白质条带,其中在25kDa附近3条为主带。


在与11份患者血清的反应中,共检测到分子量近似为28、35、37、65、90kDa的阳性蛋白条带。其中28、35、37、65kDa处的蛋白条带与血清的阳性反应率达到了100%。提示家蚕蚕蛹中确实存在着特定的过敏原蛋白。


2、家蚕蚕蛹过敏原的蛋白质组学研究:实验目的是通过双向电泳、免疫印迹、质谱的方法对家蚕蚕蛹过敏原有更明确的研究。


首先用双向电泳对家蚕蚕蛹蛋白进行分离,构建较为完整的家蚕蚕蛹蛋白双向电泳图谱;接着利用免疫印迹方法,使电转印到膜上的蛋白与阳性家蚕蚕蛹过敏患者混合血清进行反应,对于能够与过敏病人血清中IgE结合的蛋白进行质谱鉴定。


实验结果显示:家蚕蚕蛹蛋白在双向电泳中被成功分离,共得到288个蛋白点。在免疫印迹实验中,共有13个蛋白点可以与家蚕蚕蛹过敏病人血清发生阳性反应,而在阴性对照中,未见其发生阳性反应;对这13个阳性点进行质谱鉴定后,发现它们分别属于6类不同的蛋白:卵黄原蛋白、30K家族蛋白、几丁质酶、丙糖磷酸盐异构酶、热休克蛋白20.8和家蚕血液胰凝乳蛋白酶抑制剂。


3、家蚕蚕蛹过敏原蛋白几丁质酶原核表达载体的构建。


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